二硫鍵，又稱S?S鍵，是2個(gè)巰基被氧化而形成的?S?S?形式的硫原子間的共價(jià)鍵，在蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)形成上起著一定的重要作用。為了確定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，首先必須將二硫鍵打開，使之成為線狀多肽鏈。DTT和TCEP是常用的還原二硫鍵的試劑，那二者在使用中有什么不同呢？
 
DTT中文名稱為二硫代蘇糖醇，是蘇糖醇的C-1及C-4位羥基置換成巰基的化合物，常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。
 
DTT有兩個(gè)巰基基團(tuán)，其作用能維持3~7天，揮發(fā)性不強(qiáng)，使用時(shí)可以直接加入到懸滴中去，或通過微透析的方法加入。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部（溶劑不可及）的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑，如鹽酸胍、尿素或SDS）。反之，根據(jù)DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。另外，DTT可以使Ni被還原，因此在用Ni柱純化帶有His標(biāo)簽的蛋白時(shí)要避免使用DTT，而應(yīng)該考慮TECP。
 
二硫鍵的斷裂通常需要有大量的自由巰基和二硫鍵交換，三價(jià)膦系衍生物由于其較強(qiáng)的還原能力和對(duì)二硫鍵的選擇還原性得到很多研究者的青睞。這類還原劑的還原是一個(gè)定量反應(yīng)的過程，其原理是其中心原子“P”所帶的孤電子對(duì)能與氧原子形成配位共價(jià)結(jié)合而具有還原性。如下式所示:
 
TCEP，三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽，是三價(jià)磷系衍生物中作用最優(yōu)的。它是一種無色、無味、易溶于水的弱還原性物質(zhì)，在水中溶解度能達(dá)到310mg/mL。其在空氣和水溶液中具有較高的穩(wěn)定性，受溫度和濃度的影響小。TCEP是一種極為合適的部分還原試劑，對(duì)還原二硫鍵選擇性極強(qiáng)，除半胱氨酸外，幾乎沒有與其它氨基酸的副反應(yīng)，并且能在更寬的pH值范圍包括酸性條件(pH值3)下使用，從而有效減少酰胺鍵的水解。TCEP的反應(yīng)活性溫和、易溶、毒性小，且更容易操作，在酸性、堿性溶液中的穩(wěn)定性都很好。而且還原能力比DTT強(qiáng)，它的作用可以維持2~3周，是公認(rèn)的DTT(二硫代蘇糖醇)的一種良好替代物。
 
DTT(二硫代蘇糖醇)和TCEP（三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽）可以相互代替，只是效果不同而已。與DTT相比，TECP還原能力更強(qiáng)，更具有選擇性；無論在酸性還是堿性條件下都更加穩(wěn)定；本身不帶有電荷，不影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在某些巰基的交聯(lián)反應(yīng)中不需要除掉，因而在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究常常優(yōu)先選擇TCEP。
 
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